|
Die Vorteile der Einzelmoleküluntersuchungen bei T=2K, verglichen mit Raumtemperaturexperimenten, sind die
wesentlich größere Photostabilität der Komplexe und die schmalen Linien der Fluoreszenz- und Absorptionspektren. Dies ist einerseits
auf die stark verringerte Diffusion von Sauerstoff in der Probe (Photostabilität) andererseits auf verminderte Schwingungen des
Proteinskeletts (schmale Linien) zurückzuführen. Ein für diese Experimente verwendbarer Aufbau ist in der Abbildung links schematisch
dargestellt.
Das Anregungslicht des Lasers gelangt über die Scanvorrichtung und ein telezentrisches System zum Objektiv. Objektiv und Probe befinden
sich im Innern des Kryo-staten und werden von superfluidem Helium umspült. Als Anregungslichtquellen stehen mehrere Laser zur Verfügung.
Mittels einer Glasfaser wird das Licht auf den schwingungsgedämpften Tisch des optischen Aufbaus geführt. Um eine hohe Transmission des
Fluoreszenzlichtes zu erreichen, wird als Strahlteiler eine einseitig beschichtete Glasscheibe (r=2,5cm) mit einer Dicke von einem
Zentimeter gewählt. Somit kann der ohnehin schwächere Reflex der 2. Oberfläche durch ein Diaphragma ausgeblendet werden. Der Scanner
besteht aus zwei Scanspiegeln, die durch Galvanometer verkippt werden können. Angesteuert wird dieses beam scanning System über den
Messcomputer mit Hilfe einer D/A Karte. Der verkippte Strahl wird mittels eines telezentrischen Systems, bestehend aus zwei Linsen
(Brennweite f=25cm) so geführt, dass die Hauptebene des Objektives immer an der selben Stelle getroffen wurde. Eine Verkippung des
Strahles führt somit zu einem Abrastern der Probe.
Das Objektiv und die Probe befinden sich im Innern des Kryostaten. Der Kryostat ist ein kombinierter Fluss- Badkryostat, mit dem
Temperaturen von bis zu 1,5 K (superfluides Helium) erreichbar sind. Das Fluoreszenzlicht durchläuft dieselbe Optik. Um reflektiertes
Anregungslicht zu filtern, wird nach dem Strahlteiler ein holographischer Notchfilter angebracht.
Als Detektor stehen eine Avalanche-Photodiode und ein Spektrometer, bestehend aus einem Gitterspektrographen und einer stickstoffgekühlten,
rückbeleuchteten CCD-Kamera zur Verfügung. Die TTL-Pulse der APD werden mit Hilfe eines am Institut geschriebenen Programmes in
zweidimensionale Bilder (Images) des gescannten Bereichs oder in Timetraces eines festen Punktes auf der Probe umgewandelt.
In der Abbildung rechts ist ein Beispiel eines mittels der APD aufgenommenen Images bei T=2K dargestellt.Das linke Teilbild zeigt ein
Konfokales Fluoreszenzbild einzelner Moleküle, das rechte Teilbid das dazugehörige Fluoreszenz- Emissionsspektrum eines angesteuerten
Punktes. Der Scanbereich beträgt bei einer Mittelungszeit von 6ms pro Pixel. Die hellen Punkte werden der Fluoreszenz einzelner Moleküle
zugeordnet. Sie entsprechen der Abbildung des Fokalvolumens und haben eine laterale Ausdehnung von ca. 1µm , was deutlich über dem
theoretischen Limit von ca. 300nm liegt. Dies ist auf die nicht optimalen Abbildungseigenschaften des Aufbaus zurückzuführen. Mit Hilfe der
Scanvorrichtung können einzelne Punkte angefahren und spektroskopisch untersucht werden.
|
